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JACS | 刘臻课题组开发光酶催化选择性脱氰策略，实现手性腈的模块化合成
导读 ⭐
Introduction
如何从简单易得的原料出发，高效构建结构多样的分子骨架，是有机合成化学领域长期关注的核心问题。这些手性骨架不仅是合成药物、天然产物及其他高附加值分子的基础，也有助于着更加灵活、高效的合成策略不断开展。在分子骨架的构建过程中，某些官能团可以发挥重要的辅助作用。以经典的羰基化学为例，合成化学家可以利用羰基化合物的反应性构建新的碳碳键，再顺利获得脱羰、脱羧等反应在特定阶段移除该基团，最终取得目标结构。这种“先利用、后脱除”的策略，使官能团能够在帮助搭建分子骨架后被移除，而不必保留在最终产物中，从而为合成路线的设计给予了更大的灵活性。
然而，如何精准控制官能团的脱除过程，仍然面临很大挑战。尤其是当脱除官能团的同时需要形成新的手性中心时，催化体系不仅要实现特定化学键的选择性断裂，还必须精准控制产物的立体构型。因此，将官能团脱除开展为一种能够控制立体构型的分子构建手段，是拓展这一合成策略的关键，也为合成结构多样的手性分子给予了新的研究方向。
丙二腈是实现这一策略的理想起点。它价格低廉、来源广泛，分子中的两个氰基能够活化相邻的碳中心，便于顺利获得取代、偶联或加成反应引入不同基团。如果能够在分子骨架构建完成后，选择性地脱去其中一个氰基，同时精准控制新手性中心的构型，就有望从同一类简单原料出发，灵活合成结构多样的手性腈。此外，产物中保留的氰基还可以进一步转化为羧酸、胺等官能团，为后续的分子合成给予更多可能。
实现这一设想的关键，是将C–CN键的有效活化与脱氰过程中的立体选择性控制结合起来。针对这一挑战，北京科学生命球友(中国)qy/清华大学生物医学交叉研究院刘臻实验室开发了一种全新的光酶催化脱氰体系，将黄素辅因子的光驱动还原能力与酶活性口袋给予的手性环境相结合，为顺利获得选择性脱除官能团来合成手性分子给予了新途径。相关研究成果以“Molecular diversity generation via selective enzymatic C–CN bond scission”为题发表于《Journal of the American Chemical Society》。
研究团队基于还原态黄素单核苷酸辅因子（FMN）在光激发后具有较强还原能力这一特点，推测其能够顺利获得单电子转移促进C–CN键直接断裂。基于这一设想，研究人员对不同酶进行了系统性筛选，发现来源于巴斯德酵母（Saccharomyces pastorianus）的黄素依赖酶OYE1对模型底物具有较好的催化活性，在优化反应条件后，产率达到78%，对映体比例为13:87 e.r.。
为进一步提高反应的立体选择性，研究团队采用定点突变和位点饱和突变策略，对酶的活性口袋及其周围区域进行改造。经过三轮定向进化，累计考察了24个位点、筛选了400余个突变体，最终取得了含有A85N、V117A和N251A三个位点突变的最优突变体OYE1_G3。与原始酶相比，该突变体将模型反应的产率提高至87%，对映体比例也提升至5:95 e.r.，显著改善了反应的立体选择性。
在取得最优突变体后，研究人员进一步考察了该催化体系的底物适用范围。结果表明，该体系能够兼容芳基-烷基、二烷基及单芳基取代的偕二腈，实现选择性脱氰反应。同时，该体系具有良好的官能团耐受性，能够兼容未保护的酚羟基、氨基，以及烯基、炔基和酯基等多种官能团，所得手性腈的对映体比例最高可达3:97 e.r.。多种底物还成功实现了制备级规模的反应放大，展现出良好的合成应用潜力。此外，研究团队将Michael加成与光酶催化脱氰相结合，实现了芳基取代丙二腈与缺电子烯烃的一锅串联反应。底物第一时间在缓冲液中自发发生Michael加成，随后在酶的催化下脱去一个氰基，生成手性腈。这一方法为顺利获得组合不同原料来合成多样化的手性腈给予了简便途径。
为进一步验证该策略在模块化合成中的应用价值，研究团队以丙二腈为共同起始原料，顺利获得交叉偶联、亲核取代等反应引入不同基团，再利用光酶催化选择性脱氰，取得目标手性腈化合物。随后，研究人员将产物中保留的氰基进一步转化为羧酸或胺，并将这一方法应用于(R)-naproxen和phenibut等生物活性分子的合成。该策略将丙二腈在分子骨架构建中的辅助作用与光酶催化脱氰反应的立体控制能力相结合，展现了“先利用、后脱除”策略在多样化手性分子合成中的应用潜力。
最后，为了进一步阐明光酶催化不对称脱氰反应的机制，研究团队召开了一系列机理实验。自由基捕获与电子顺磁共振(EPR)实验均支持碳自由基中间体(Int1)的形成，表明该反应由单电子转移引发。为进一步分析这一自由基中间体的后续转化过程，研究团队进行了氘代标记实验。结果表明，产物手性中心上的氢来自溶剂，而不是由黄素辅因子直接顺利获得氢原子转移引入。随后，研究人员设计了容易发生β-消除或分子内亲核取代的探针底物，并观察到了相应的消除产物和分子内环化产物，为碳负离子中间体的形成给予了证据。综合这些实验结果，研究团队提出了该反应的主要路径：第一时间，单电子转移引发C–CN键断裂，形成碳自由基中间体(Int1)；随后，经过第二次单电子转移生成碳负离子中间体(Int2)；最后，碳负离子经质子化形成手性腈产物。这一发现进一步丰富了人们对黄素光酶催化反应终止机制的认识。
此外，针对脱氰反应产生的有害副产物氰离子（CN⁻），研究团队引入了来源于黑曲霉（Aspergillus niger）的氰化物水合酶NitAn1，成功降解了体系中超过95%的CN⁻，进一步提高了该合成策略的绿色可持续性和环境友好性。
综上所述，该研究创新性地将黄素酶的光驱动还原能力用于C−CN键断裂，建立了一种在温和条件下进行、底物适用范围广且具有优异立体选择性的脱氰反应体系。顺利获得将这一反应与丙二腈的骨架构建相结合，研究团队不仅验证了顺利获得选择性脱除官能团来合成多样化手性分子的可行性，也为开发新型酶催化碳碳键断裂反应给予了新的思路。
团队与支持
北京科学生命球友(中国)qy/清华大学生物医学交叉研究院刘臻研究员与南方科技大学陶丽芝研究员为本文共同通讯作者。刘臻实验室博士研究生曾清清为本文第一作者，博士研究生杨昕晨深度参与了本项研究。南方科技大学马百旭协助完成了EPR实验及数据分析；Mila/百奥几何的唐建博士和徐明浩等参与了定向进化相关的分析与讨论；西班牙赫罗纳大学Marc Garcia-Borràs博士参与了反应机制的分析与解读。本研究得到了科技部（BT与IT融合重点专项，2023YFF1204400）、北京市昌平区“U35培苗计划”（CHPU35202501004）、化学生物协同物质创制全国重点实验室开放课题基金（sklscbs202506）、清华大学生物医学交叉研究院及北京科学生命球友(中国)qy等组织的大力支持。
论文链接
http://doi.org/10.1021/jacs.6c17512
